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本试剂盒适用于从各种动物血小板中提取膜蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（HR0389）。

• 使用方便，蛋白提取的时间约1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

• 提取液准备：
  每500μL冷的蛋白提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  每500μL蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取1～5mL ACD抗凝血，室温200×g离心10分钟。
  注：
  ● 离心力在180～220×g均可，不要大于250×g。
  ● 最好用尽可能新鲜的血样。
  
• 收集上层血浆，弃下层血液细胞沉淀。
  注：如果血浆层与红细胞层之间形成白膜，小心吸取白膜层加入上层血浆。
  
• 上层血浆室温3000×g离心15分钟，弃上清，收集沉淀。
  注：
  ● 如果对血小板低活化程度要求较高，血小板需要进行再培养等处理，此步骤离心力可以降低到2000×g，离心时间缩短至5分钟。
  ● 降低离心力和缩短离心时间会降低蛋白回收率。
  
• 沉淀中加入500μL提取液B洗涤一次，3000g离心15分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 沉淀中加入300～500μL冷的蛋白提取液A，充分混匀后，在4℃条件下振荡30～50分钟。
  注：
  ● 必须在2～8℃条件下振荡。
  ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体有轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件可以不振荡，2～8℃静置，稍微延长处理时间即可，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心10分钟，取上清。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心3分钟。
  注：
  ● 此步骤必须37℃条件下离心。
  ● 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液澄清，分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。
  
• 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部的下层，大约30～50μL液体。
  注：下层为粘稠状液体。
  
• 用1～2倍体积的膜蛋白溶解液C溶解该液体，即得血小板膜蛋白样品。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  血小板膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大血小板的上样量。
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。